文章简介
英文题目：Discrepanciesamonghealthy,subclinicalmastitic,andclinicalmastiticcowsinfecalmicrobiomeandmetabolomeandserummetabolome
中文题目：健康奶牛、亚临床乳腺炎奶牛和临床乳腺炎奶牛在粪便微生物组、代谢组和血清代谢组方面的差异
期刊名：Journalofdairyscience
发表时间：年8月2日
IF：4.
作者单位：中国农业科学院
DOI号：10./jds.-
组学技术：非靶向代谢组学+微生物多样性
样品来源：奶牛血清+粪便
研究背景
乳腺炎通常被认为是一种由外源性病原体入侵引起的局部炎症疾病，会导致牛奶中微生物群和代谢物的失调。然而，肠-乳通路理论可能会在一些内源性肠道细菌与乳腺炎的发生和发展之间建立一种可能的联系。因此，作者旨在采用非靶向代谢组学和微生物多样性技术探究健康奶牛和亚临床乳腺炎和临床乳腺病奶牛的肠道微生物群特征以及肠道和血清中代谢物组成的差异。
研究结果
1.粪便的微生物群落组成与多样性分析
经过测序，作者从45份粪便样本中共获得个高质量的16SrRNA基因序列，并通过聚类获得个OTU，相似度为97%。三组间粪便微生物群落的α多样性存在显著差异。在群落丰富度方面，与健康组（H）组相比，亚临床乳腺炎组（SM）和临床乳腺炎组（CM）组的ACE和Sobs指数显著下降。与SM组相比，CM组的ACE指数显著下降。在群落多样性方面，CM组的Simpson和Shannon指数低于H组和SM组（图1）。根据OTU和取样读数的数量，获得了稀疏曲线，随着读数数量的增加，曲线趋于平缓，表明测序深度足够。对OTU进行分类注释，以确定粪便微生物群落的组成和相对丰度。在17个细菌门中，Firmicutes、Actinobacteriota、Bacteroidota和Proteobacteria的丰度最高。
在属水平上，在所有粪便微生物群中检测到属，其中Bifidobacterium、UCG-、Romboutsia、Paeniclostridium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group、Turicibacter、Clostridium_sense_stoto_1、Christensenellaceae_R-7_group和norank_f__Muribaculaceae在H、SM和CM组的丰度较高。
图1三组粪便样本的群落丰富度和多样性分析
2.不同群体奶牛粪便微生物区系的差异
利用β多样性分析初步区分H、SM和CM奶牛粪便微生物谱的差异。如图2所示，基于Bray-Curtis距离算法和分析的PCoA和NMDS显示，H、SM和CM组的粪便微生物群存在空间分离。CM和H组样本之间的距离大于SM和H组之间的距离，这表明CM和H奶牛之间的粪便微生物特征差异较大。
在随后的比较中，对粪便微生物群相对丰度的KruskalWallisH分析（图3A和B）和LEfSe分析（图3C和D）表明，CM组中的Proteobacteria（LDAscore=4.07)更为丰富，然而，与其他两组相比，CM组的Actinobacteria数量较少（LDAscore=2.96）。在属水平上，Bifidobacterium（LDAscore=4.41）、Romboutsia（LDAscore=4.20）、Lachnospiraceae_NK3A20_group（LDAscore=3.42）、Coprococcus（LDAscore=3.42），与其他两组相比，H组中的Ruminococcus（LDAscore=3.64）和Alistipes（LDAscore=4.06）显著增多。（图3A和B）此外，Lactobacillus（LDAscore=2.74），Lachnospiraceae_NK4A_group（LDAscore=2.65），在H组中，unclassified_f__Ruminococcaceae（LDAscore=2.60）和unclassified_f__Peptostreptococcaceae（LDAscore=2.50）更为丰富。相比之下，SM组中Paeniclostridium（LDAscore=3.57）和Klebsiella（LDAscore=3.49）的检出率明显更高。SM组中Corynebacterium（LDAscore=2.94）和Enterococcus（LDAscore=2.81）的检出率更高。CM组中Escherichia-Shigella（LDAscore=3.60）的数量明显更多。此外，Streptococcus（LDAscore=2.62）在CM组更为丰富。
图2三组在OTU水平上粪便微生物群的β多样性分析
图3三组粪便样品中不同微生物的物种差异分析
3.不同群体奶牛粪便和血清的代谢谱
主成分分析提供了H、SM和CM组之间代谢物谱的总体差异。在粪便（图4A）和血清样本（图4B）的PCA评分图中，代表3组代谢物的符号明显分布在不同象限中。组间的分隔符号距离远大于组内，表明不同乳房健康状况的奶牛粪便和血清中的代谢物存在显著差异。为了进一步确定各组间代谢物的差异，数据由PLS-DA处理。粪便和血清样本中的PLS-DA评分图显示了H、SM和CM组代谢物分布的差异（图5A和C）。模型参数R2X（cum）和R2Y（cum）分别表示为对模型的X矩阵和Y矩阵的累积解释率。R2X（cum）和R2Y（cum）值0.5，表明具有较高的预测能力。反应排列测试用于验证PLS-DA模型的准确性。响应排列测试中Q20的值表明PLSDA模型没有过度填充（图5B和D）。
作者分别在粪便和血清样本中鉴定共有个（在正离子和负离子模式下分别为和个）和个（在正负离子模式分别为和个）代谢物。在超类别水平上，粪便和血清样本中脂类和类脂分子（34.7%和44.3%）、有机酸和衍生物（17.1%和16.9%）以及有机杂环化合物（16.2%和12.2%）占主导地位。在亚类水平上，氨基酸、肽和类似物（14.2%）、碳水化合物和碳水化合物结合物（5.17%）、脂肪酸和结合物（4.68%）、三萜类（3.07%）、羰基化合物（2.58%）以及胆汁酸、醇和衍生物（2.58%）是粪便样本的主要成分。血清中，氨基酸、肽和类似物（14.0%）、甘油磷酸胆碱（9.55%）、甘油磷乙醇胺（6.50%）、碳水化合物和碳水化合物结合物（5.69%）、脂肪酸和结合物（4.67%）以及胆汁酸、醇和衍生物（2.44%）最为丰富。
图4三组粪便和血清代谢组学的PCA分析
图5三组粪便和血清代谢组学的PLS-DA分析
4.不同群体奶牛的差异粪便和血清代谢产物
为了初步显示H、SM和CM组之间代谢物分布的差异，对粪便和血清样本中含量最高的50种丰富代谢物进行了分层聚类分析（图5A和B）。FDR调整后的P值0.05、VIP值1.0、Foldchange值1.5或0.67的代谢物被定义为差异代谢物。有趣的是，作者在粪便和血清代谢物中观察到一些相似之处和一些不同之处（表1和表2）。二十碳六烯酸（20-trihydroxy-leukotriene-B4和13,14-hihydro-15-keto-PGE2）和亚油酸及其衍生物（9,10-dihydroxylinoleicacids）增加，次级胆汁酸（SBA）代谢物（Deoxycholicacid、12-ketolithocholicacid、3a,7a,12a-trihydroxy-5b-cholestan-26-al）、3-羟基己酰肉碱、1-亚油酸甘油磷酸胆碱均存在于CM组奶牛的粪便和血清中。相反，CM和SM奶牛的粪便和血清中检测到初级胆汁酸（PBA）代谢物（Taurocholicacid）、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酸升高。此外，与H组相比，SM和CM奶牛血清中SBA（7-ketodeoxycholicacid、taurochenodeoxycholicacid、12alpha-hydroxy-3-oxo-5beta-cholan-24-oicacid和deoxycholicacidglycineconjugate）的丰度较低。此外，CM和SM奶牛的粪便中还观察到乳糖、蜜二糖、环腺苷酸（cAMP）、尿酸、l-谷氨酸和l-谷氨酰胺的减少。在血清样本中，CM组与其他两组相比，12-oxo-20-dihydroxy-leukotrieneB4、1-磷酸鞘氨醇和乳糖神经酰胺（d18:1/18:1（9Z））的丰度更高。
表1三组奶牛血清差异代谢物的详细信息
表2三组奶牛粪便差异代谢物的详细信息
图6三组粪便和血清代谢组学各自差异代谢物的层次聚类分析
5.差异代谢物的代谢途径分析
表3和表4分别列出了粪便和血清中不同代谢物显著富集的代谢途径。在粪便和血清中，参与花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和PBA生物合成途径上的代谢物在CM组和SM组上调。相反，CM组和SM组嘌呤代谢、肉碱代谢、柠檬酸循环以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径中的代谢物均下调。此外，CM组的SBA生物合成途径上代谢物下调。
表3三组奶牛粪便中差异代谢物的代谢途径分析
表4三组奶牛血清中差异代谢物的代谢途径分析
6.粪便微生物组与粪便和血清中代谢物的相关性
Spearman相关系数表明，粪便中的Bifidobacterium、Lachnospiraceae_NK3A20_group、Lachnospiraceae_NK4A_group、Ruminococcus、unclassified_f__Ruminococcaceae、Alistipes和Prevotellaceae_UCG-与SBA代谢物呈正相关，并与粪便和血清中的13,14-dihydro-15-keto-PGE2、20-trihydroxy-leukotriene-B4和9,10-dihydroxylinoleicacids呈负相关。然而，Escherichia-Shigella和Streptococcus与粪便和血清中的13,14-dihydro-15-keto-PGE2和20-trihydroxy-leukotriene-B4呈正相关，但与12-酮石胆酸、脱氧胆酸和3a,7a,12a-yrihydroxy-5b-cholestan-26-a呈负相关（图7A和B）。
在粪便中，Bifidobacterium、Ruminococcus和Lachnospiraceae_NK3A20_group与另一种SBA代谢物7alpha-hydroxy-3-oxochol-4-en-24-oicacid呈正相关，与PBA代谢品牛磺胆酸和甘胆酸呈负相关。粪便中的13-hydroperoxyoctadeca-9,11-dienoate与Escherichia-Shigella、Streptococcus、Paeniclostridium、Klebsiella和Corynebacterium呈正相关，但与Bifidobacterium、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK3A22_group、Coprococcus、Alistipes和Prevotellaceae_UCG-呈负相关，Paeniclostridium、Klebsiella和Corynebacterium均与13-hydroxyoctadecadienoicacid和磷脂酰乙醇胺呈负相关（图7A）。在血清中，Bifidobacterium、Lachnospiraceae_NK3A20_group和unclassified_f__Ruminococcaceae与脱氧胆酸甘氨酸结合物呈正相关。
Bifidobacterium、Ruminococcu和Lachnospiraceae_NK3A20_group与牛磺酚脱氧胆酸呈正相关。Escherichia-Shigella与12-oxo-20-trihydroxy-leukotrieneB4、9,10-dihydroxylinoleicacids和乳糖神经酰胺（d18:1/18:1（9Z））呈正相关。Paeniclostridium、Klebsiella和Corynebacterium与溶血磷脂酰胆碱[LysoPC（17:0）]、PE[14:0/24:1（15Z）]和白三烯D4呈正相关（图7B）。
图7粪便中差异菌属分别与粪便和血清中差异代谢物之间的相关性分析
7.血清炎症细胞因子、抗氧化指数、脂质和LPS浓度
与H组奶牛相比，CM奶牛血清中IL-1β、IL-2、TNF-α、TC和TG浓度显著升高，IL-10、GSH-Px和HDL浓度显著降低。CM组和SM组的TNF-α浓度没有差异（表5）。CM奶牛血清和粪便中的LPS浓度比H奶牛和SM奶牛明显升高，SM奶牛的血清LPS浓度也比H奶牛显著上调（图8A和B）。
表5三组奶牛血清中炎症细胞因子、抗氧化指数、脂质含量的统计学分析
图8三组奶牛粪便样本中的脂多糖浓度对比
研究结论
在该研究中，H、SM和CM组奶牛的粪便微生物群分布不同。乳牛肠道中的病原菌和潜在促炎细菌（Paeniclostridium、Escherichia-Shigella和Klebsiella）较丰富，而益生菌和有益共生细菌（Bifidobacterium、Romboutsia、Lachnospiraceae_NK3A20_group、Coprococcus、Prevotellaceae_UCG-和Alistites）较少，这是肠道微生物群落多样性下降的原因。此外，该研究还从三组奶牛的粪便和血清中均发现高水平的脂质促炎代谢物和低水平的SBA以及与能量和嘌呤代谢有关的化合物。同时，血清中SOD、GSH-Px和HDL的降低以及TC和TG的升高反映了乳腺炎伴随的氧化应激和脂质代谢变化。该研究有助于更好地了解奶牛乳腺炎的发病机制。